Bahan Belajar (Dasar Teori) : Modul Dinamika Level Tangki (DLT)-Praktikum OTK II Teknik Kimia USK

 Ekstraksi dan Isolasi Flavonoid yang Ada Pada Ekstrak Metanol Daun Acanthospermum Hispidium Dc

ilustrasi proses ekstraksi

            Bahan aktif fitokimia merupakan bahan aktif esensial yang tidak ditemukan dalam tubuh manusia. Zat fitokimia merupakan hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tumbuhan. Zat fitokimia memiliki aktivitas antioksidan, sebagai sistem pertahanan sel dalam melawan kerusakan oksidatif dan menurunkan perkembangan kanker.

        Bahan aktif fitokimia merupakan bahan aktif esensial yang tidak ditemukan dalam tubuh manusia. Zat fitokimia merupakan hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tumbuhan. Zat fitokimia memiliki aktivitas antioksidan, sebagai sistem pertahanan sel dalam melawan kerusakan oksidatif dan menurunkan perkembangan kanker.

Daun Acanthospermum Hispidium Dc merupakan salah satu contoh bagian tanaman yang mengandung banyak bahan aktif fitokimia. Zat fitokimia antara lain flavonoid, tannin, glikosida, saponin, steroid dan alkaloid. Pengisolasiaan bahan aktif yang dikandung oleh Acanthospermum Hispidium Dc dilakukan dengan beberapa metode pemisahan.

Dalam ekstraksi dan isolasi flavonoid daun Acanthospermum Hispidium Dc dapat ditemukan pada ekstrak metanol. Beberapa metode yang digunakan untuk mengiosolasi diantaranya maserasi, destilasi, ekstraksi cair-cair, kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis dan uji screnning fitokimia.

A.  Preparasi Sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian tersebut adalah daun Acanthospermum hispidium DC. Tahap pertama dalam preparasi sampel adalah pencucian Acanthospermum hispidium DC yang bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang terdapat padasampel. Selanjutnya sampel dikeringkan untuk menghilangkan air sisa pencucian, kemudian sampel dipotong kecil-kecil untuk meningkatkan luas permukaan dan mempercepat proses pengeringan serta memudahkan dalam proses penggilingan. Pengeringan dilakukan untuk mengurangi kadar air dalam sampel, mencegah terjadinya reaksi enzimatis dan mencegah tumbuhnya jamur sehingga dapat disimpan serta agar komposisi komponen kimia yang terkandung dalam sampel tidak mengalami perubahan (Halimah, 2010).

Selanjutnya dilakukan penggilingan untuk mendapat sampel dalam bentuk serbuk, sehingga proses ekstraksi menjadi lebih efektif,karena dapat  meningkatkan kesempatan kontak antara cairan penyari dengan simplisia. Bobot serbuk yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 1000 gram.

B.  Metode Pemisahan

Dalam pemisahan senyawa dilakukan beberapa metode pemisahan yaitu sebagai berikut :

1.    Maserasi

Proses penyarian yang dipilih dalam penelitian ini adalah ekstraksi padat cair atau maserasi. Maserasi dipilih karena metode ini merupakan metode yang sederhana yang dilakukan dengan merendam serbuk sampel dalam suatu pelarut yang sesuai dengan jangka waktu tertentu. Selain itu, metode maserasi merupakan metode dingin, karena tidak ada pemanasan dalam proses penyarian, sehingga kemungkinan terjadinya dekomposisi komponen kimia yang dikandung oleh sampel dapat dihindari. Dalam maserasi pelarutan zat aktif didasarkan atas sifat kelarutannya dalam suatu pelarut. Pelarut akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel, sehingga isi sel akan larut dalam pelarut karena adanya perbedaan konsentrasi larutan di dalam  dan di luar sel. Selanjutnya akan terjadi proses difusi larutan dari dalam sel menuju keluar sel sehingga dengan mekanisme tersebut komponen kimia dapat tertarik keluar sel.

Pelarut yang digunakan untuk menyari simplisia adalah metanol. Metanol merupakan pelarut yang universal karena dapat memisahkan senyawa yang bersifat polar sampai non polar, metanol merupakan pelarut yang dapat menarik komponen-komponen yang terkandung dalam simplisia, selain itu metanol bersifat mudah menguap sehingga akan mudah dipisahkan dari filtrat.

Maserasi dilakukan selama 2 hari dimana pelarutdiganti  setiap 24 jam, dengan tujuan untuk menjaga kondisi pelarut segar, sehingga dalam melakukan proses penyarian secara efektif. Dalam jangka waktu tersebut diprediksi semua komponen akan terekstrasi. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring. Penyaringan bertujuan untuk menghilangkan pengotor- pengotor yang terdapat dalam sampel, baik berupa zat pengotor maupun pewarna yang terkontaminan.

2.    Destilasi

Tahap selanjutnya adalah destilasi. Destilasi dilakukan untuk memurnikan filtrat dari sisa pelarut yang digunakan ketika maserasi. Destilasi merupakan suatu metode pemisahan yang didasarkan atas kecepatan menguap dengan perbedaan titik didih, dimana senyawa yang memiliki titik didih lebih rendah akanlebih mudah menguap. Kemudian uap akan terkondensasi membentuk cairan dengan bantuan kondensor (pendingin). Pada penelitian ini, penulis menafsirkan bahwa dalam metode destilasi digunakan untuk menguapkan pelarut yang terdapat didalam ekstrak yaitu metanol.

Metanol merupakan pelarut organik yang memiliki titik didih 64,5⁰ dan 65,5⁰(Depkes RI, 1979). Sedangkan dalam simplisia Acanthospermum hispidium DC terkandung zat fitokimia yang memiliki titik didih lebih tinggi dibandingkan metanol. Metanol memiliki titik didih yang lebih rendah akan mengalami penguapan lebih dahulu, sehingga destilat yang tertampung pada labu penampung merupakan metanol, sedangkan komponen kimia akan tetap berada pada labu destilasi.

Dari metode destilasi ini akan diperoleh hasil dengan konsentrasi yang lebih pekat dan lebih murni dari zat pengotor. Bobot ekstrak yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 98,3 gram.

3.    Ekstraksi Cair- cair

Prosedur ekstraksi cair-cair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang bersifat nonpolar atau agak polar. Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat nonpolar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan juga senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air (Gandjar dan Rohman, 2009).

Proses ekstraksi yang dilakukan terhadap ekstrak uji adalah ekstraksi cair-cair ekstrak dengan n-heksana, kloroform, etil asetat, n-butanol dan air. Penggunaan pelarut tersebut diurut berdasarkan tingkat kepolarannya. Pada saat ekstraksi cair-cair, ekstrak hasil destilasi ditambahakan dengan masing-masing pelarut kemudian dilakukan penggojongan. Penggojogan bertujuan agar komponen kimia terdistribusi ke dalam dua fase yang tidak saling campur. Komponen kimia akan terdistribusi pada masing-masing fase yang didasarkan atas kemampuan distribusi komponen tersebut yang dipengaruhi oleh tingkat kepolaran komponen.

            Setelah dilakukan pemurnian dengan ekstraksi cair-cair dilanjutkan dengan tahap uji screening fitokimia untuk mengetahui senyawa apa saja yang terdapat didalam berbagai ekstrak pelarut.

 

C.  Uji Screening

Uji screening dilakukan untuk menguji kandungan yang terdapat pada ekstrak kental dan hasil ekstraksi cair-cair. Dengan menggunakan uji screnning akan dapat diketahui ada tidaknya senyawa fitokimia pada masing-masing pelarut ekstrak yang diperoleh. Uji screnning tersebut adalah sebagai berikut :

1.    Uji Flavonoid

Pada uji flavonoid peneliti menggunakan pereaksi NaOH. 1 mL NaOH 10% ditambahkan dengan 3 mL ekstrak terbentuknya warna kuning mengindikasikan bahwa ekstraks tersebut mengandung flavonoid.

Hal ini terjadi karena adanya reaksi antara flavonoid dengan pereaksi NaOH yang membentuk garam dan membentuk struktur kinoid pada cincin B yang akan membuat ikatan rangkap terkonjugasi menjadi lebih panjang sehingga akan meningkatkan intensitas warnanya (Robinson, 1995).

2.    Uji Tanin

Pada pengujian adanya tannin peneliti menambahkan 1 mL KOH 10% ke dalam ekstrak terbentuknya endapan putih menandakan adanya tannin.

Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian, senyawa tannin tidak ditemukan dalam semua ekstrak yang diuji, hal ini dikarenakan dengan penambahan 1 mL KOH 10% tidak terbentuknya endapan putih.

3.      Uji Glikosida

Pada pengujian glikosida 1 mL ekstrak dalam tabung reaksi ditambahkan 10 mL H₂SO₄ 50%, campuran dipanaskan diatas air mendidih selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 10 mL larutan fehling, endapan merah mengindikasikan adanya glukosa.

Proses hidrolisis terjadi karena adanya asam mineral (H₂SO₄). Hidrolisis glikosida akan menghasilkan komponen gula (glikon) dan komponen non gula (aglikon) (Sumardjo, 2009). Selanjutnya diuji dengan pereaksi fehling,dan akan terbentuk endapan merah bata. Endapan ini terjadi karena hasil hidrolisis yaitu glikon (komponen gula) akan mereduksi Cu²⁺ menjadi ion Cu⁺ yang dalam suasana basa akan diendapkan sebagai Cu₂O.

4.    Uji Saponin

Pada uji saponin dilakukan uji emulsi, dimana 5 tetes olive oil (minyak zaitun) ditambahkan  pada 3 mL ekstrak kemudian campuran dikocok, terbentuknya emulsi yang stabil menunjukkan adanya saponin dalam ekstrak uji. Emulsi yang terbentuk pada uji positif saponin, terjadi karena adanya interaksi dari busa yang khas dari saponin dengan minyak zaitun saat dikocok kuat.

5.    Uji Steroid

Pada uji salkoswki, apabila sterol dengan konfigurasi tidak jenuh di dalam molekulnya direaksikan dengan asam kuat dalam kondisi bebas air, maka akan memberikan reaksi warna.

Peneliti mengunakan uji salkowski, dimana 5 tetes H₂SO₄ pekat ditambahkan dengan 1 mL ekstrak, terbentuknya warna merah mengindikasikan adanya steroid. Penambahan H₂SO₄ bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa. Sehingga akan terbentuk cincin yang berwarna merah, selain itu gugus sulfat akan menggantikan gugus OH sehingga terbentuk kompleks warna merah.

6.    Uji Alkaloid

Pada pengujian adanya alkaloid 1 mL ekstrak ditambah 2 tetes reagen mayer, endapan berwarna cream atau putih mengindikasikan ekstrak tersebut mengandung alkaloid.

Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut merupakan kompleks kalium-alkaloid.  Alkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan ion logam. Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K⁺ dari kalium tetraiodomerkurat (II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Dayanti dan Suyanto, 2012).

D.  Identifikasi Kromatografi

1.    Kromatografi Kolom

Setelah dilakukan ekstraksi cair- cair dilakukan kromatografi kolom. Kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya (Roy, 1991).

Prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam (Yazid, 2005)

Pada metode ini digunakan fase diam bersifat polar yaitu silika gel dan fase gerak bersifat non polar yaitu n-heksana. Hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan kolom yang akan digunakan untuk pemisahan senyawa tersebut. Kemudian silika gel ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut  n-heksana sampai terbentuk lumpuran atau bubur. Kemudian lumpuran silika tersebut dimasukkan kedalam tabung dan dibuat kolom yang kompak dan terhindar dari gelembung udara yang dapat mengganggu proses pemisahan senyawa. Selanjutnya sampel dimasukkan dan dilakukan penambahan fase gerak secara berkala untuk menjaga kondisi kolom agar tidak kering. Penambahan fase gerak juga bertujuan agar selama perjalanan turun zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut (Sastrohamidjojo, 2005). Fraksi -fraksi hasil dari pemisahan tersebut ditampung di dalam vial. Dalam kromatografi kolom dilakukan 5 kali uji, yaitu uji terhadap ekstrak n-heksana, kloroform, etil asetat, n-butanol dan air.

2.    Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Metode selanjutnya yang dilakukan adalah kromatografi lapis tipis. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk mengisolasi dan memurnika senyawa.

Prinsip pemisahkan sampel didasarkan pada perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen.Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut (SkoogDA, dkk., 1996).

KLT diawali dengan penyiapan fase diam, dimana sebanyak 50 gr bubuk silika gel dimasukkan ke dalam gelas beaker dan ditambahkan dengan 100 ml aquades. Penambahan aquades bertujuan untuk membentuk campuran bubur silika gel. Kemudian bubur dilika diaduk hingga larut sempurna dan dikocok. Pengocokan dilakukan untuk memperoleh campuran yang homogen. Campuran yang terbentuk dituangkan di atas plat kaca dan dibiarkan hingga terbentuk padatan. Plat kaca berfungsi sebagai penunjang silika gel. Plat kaca yang telah dilapisi dengan silika gel dipanaskan di dalam oven selama 1-2 jam pada suhu 110^o C, sehingga diperoleh plat yang padat dan seragam.  Selain itu pemanasan pada suhu 110⁰C bertujuan untuk mengaktifasi sisi aktif plat. Silika gel (SiOH) memiliki sisi aktif –OH yang menyebabkan sifat polar dari silika.

Setelah pembuatan plat selesai, sampet ditotolkan pada plat menggunakan pipa kapiler.  Penotolan dengan menggunakan pipa kapiler bertujuan agar diperoleh totolan yang kecil. Semakin kecil totolan, hasil maka komponen akan semakin mudah dielusi, sedangkan totolan yang terlalu besar dapat menyebabkan tailing. Fraksi yang dipisahkan menggunakan metode KLT adalah fraksi yang menunjukan hasil positif setelah dilakukan uji terhadap kelas flavonoid, yaitu fraksi kloroform dan fraksi etil asetat.

Fase gerak yang digunakan dalam KLT adalah n-heksana, pemilihan n-heksana didasarkan atas sifat kepolarannya. Karena n-heksana bersifat lebih nonpolar, jika dibandingkan dengan fraksi yang diuji yaitu kloroform dan etil asetat.

Setelah fraksi ditotolkan, selanjutnya plat di elusi didalam bejana, dan akan terjadi proses pengembangan. Pengembangan terjadi akibat eluen merambat naik pada fase diam, kemudian plat dikeringkan. Pengeringan plat bertujuan untuk menghilangkan sisa pelarut yang masih terdapat pada plat. Kemudian ditambahkan penampak bercak berupa uap iodin, sehingga akan menampakkan bercak berwarna kuning gelap. Penambahan penampak bercak ini bertujuan agar spot pada komponen dapat teramati, sehingga nilai Rf yang dihasilkan oleh spot pada tiap komponen dapat dihitung. 

E.  Identifikasi Flavonoid

   Setelah dilakukan KLT kemudian dilakukan identifikasi dengan menggunakan Infra Red dan UV. Infra Red digunakan untuk menganalisis jenis flavonoid yang terkandung dalam sampel. Pada UV digunakan untuk membuktikan adanya flavonoid pada 2 komponen yang ditotolkan menggunakan kromatografi lapis tipis.

Analisis infra merah (IM) dilakukan untuk menentukan struktur komponen, sementara UV analisis digunakan untuk pita serapan yang dapat menentukan karakteristik dari senyawa yang terisolasi (Tim Penyusun, 2007).

PEMBAHASAN

Satu kilogram bubuk sampel Acanthospermum hispidium DC direndam dengan metanol selama dua hari dengan menggunakan metode maserasi.  Tahap selanjutnya adalah destilasi. Destilasi dilakukan untuk memurnikan filtrat dari sisa pelarut yang digunakan ketika maserasi. Sehingga diperoleh ekstrak sebanyak 98.3 gram .

Setelah dilakukan destilasi kemudian dilanjutkan melakukan ekstraksi cair-cair dengan menggunakan beberapa pelarut yaitu n-heksana, kloroform, etil asetat, butanol dan air. Setlah dilakukan penggojogan komponen kimia terdistribusi ke dalam dua fase yang tidak saling campur. Komponen kimia akan terdistribusi pada masing-masing fase yang didasarkan atas kemampuan distribusi komponen tersebut yang dipengaruhi oleh tingkat kepolaran komponen.

Ekstraksi cair- cair akan menghasilkan ekstrak n-heksana, kloroform, etil asetat, n-butanol dan air. Untuk memeastikan ada tidaknya kehadiran komponen kimia pada masing-masing ekstrak pelarut dilakukan pengujian screnning fitokimia.

Uji screnning fitokimia dilakukan untuk menguji adanya bahan fitokimia yang terkandung didalam ekstrak metanol, n-heksana, kloroform, etil asetat, n-butanol dan air.

Pada pengujian fitokimia terhadap ekstrak kental, diperoleh hasil positif adanya steroid dan flavonoid yang ditemukan dalam ekstrak metanol, trichloromethane, etilasetat dan ekstrak n-butanol sedangkan uji terhadap saponin, tanin, alkaloid dan glikosida menunjukkan hasil negative pada semua ekstrak uji.

Dalam kromatografi kolom dilakukan pemurniaan hasil ekstrasi cair- cair sehingga akan diperoleh hasil identifikasi yang baik pada kromatografi lapis tipis. Dalam kromatografi kolom terbentuk beberapa fraksi yang memiliki perbedaan warna antara lain fraksi N-heksana (hitam), fraksi kloroform (hijau), fraksi etilasetat (kuning), fraksi n-butanol (emas), dan fraksi air (brick red). Fraksi-fraksi yang diperoleh pada kromatografi kolom kemudian dilakukan ujiscreening fitokimia. Dimana hanya dilakukan pengujian terhadap flavonoid dan steroid, karena hanya komponen ini yang terdeteksi pada uji sebelumnya. Hasil yang diperoleh sebagai berikut :

Berdasarkan hasil percobaan diatas, dalam fraksi kloroform, etil asetat, dan n-butanol, didapat hasil positif adanya senyawa steroid dan flavonoid. Sedangkan pada fraksi n-heksana menunjukkan hasil negative terhadap steroid dan flavonoid. Pada fraksi air, hanya ditemukan kandungan senyawa flavonoid.

Berdasarkan hasil percobaan terhadap kelas flavonoid, didapat hasil positif setelah penambahan NaOH cair pada fraksi kloroform dan etil asetat. Sedangkan pada fraksi n-butanol menunjukan hasil yang negatif.

Tahap selanjutnya, digunakan metode pemisahan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis pada hasil positif terhadap uji kelas flavonoid. Kromatografi lapis tipis bertujuan untuk mengisolasi dan memurnikan senyawa. Fraksi yang digunakan dalam penotolan adalah fraksi kloroform dan etilasetat.Hasil tersebut sebagai berikut :

Berdasarkan hasil percobaan diatas, diperoleh satu spot pada setiap fraksi yang diujikan. Dimana pada komponen 1 (kloroform) menghasilkan nilai Rf sebesar 0,61 dan pada komponen 2 (etil asetat) mengahasilkan Rf sebesar 0, 48. Dan persentase berat pada komponen 1 diperoleh sebanyak 0,15% dan komponen 2 diperoleh sebanyak 0,08%. Eluen yang digunakan pada metode ini adalah n-hexana, sehingga komponen 1 (kloroform) akan memiliki harga Rf lebih besar dari pada komponen 2 (etil asetat), hal ini dikarenakan kloroform bersifat lebih nonpolar daripada etil asetat, sehingga komponen 1 (klorofom) akan lebih mudah terbawa dalam fase geraknya jika dibandingkan dengan komponen 2.

Selanjutnya dilakukan analisis dengan menggunakan Infra Red dan UV .Pada analisis Infra Red diperoleh hasil sebagai berikut :

Analisis dengan UV menunjukkan pita serapan yang spesifik pada komponen 1 dan 2. Hasil yang diperoleh sebagai berikut :

       Pada komponen 1 dan komponen 2 teridentifikasi adanya flavonoid, namun karena data spektroskopi yang tidak lengkap sehingga struktur tidak dapat dijelaskan.

Kesimpulanya adalah daun Acanthospermum Hispidium Dcmengandung steroid dan flavonoid, Komponen tersebut dapat digunakan sebagai anti tuberkolosis dan sebagai antidot dalam keracunan.

Sumber:

Abe Rita Temidayo,Department of Chemistry, University of Ibadan, Nigeria (Extraction and Isolation of Flavonoids Present in the Methanolic Extract of Leaves of  Acanthospermum Hispidium Dc)